mRNA疫苗生产：逐步工艺模拟
本文节选自“Digital Twin of mRNA-Based SARS-COVID-19 Vaccine Manufacturing towards Autonomous Operation for Improvementsin Speed, Scale, Robustness, Flexibility and Real-Time Release Testing”，由于水平有限，详细的更多内容，请参考原文或往期推送“用于mRNA疫苗的数字孪生，优化速度、规模、稳健性、灵活性以及实时放行检测”。
工艺拼合
这里介绍的mRNA生产工艺有三个主要步骤。首先是pDNA，在转录过程中用作模板，其通过发酵以及随后的纯化和线性化生产。第二个主要的生产步骤是将刺突蛋白编码基因从线性化的DNA转录成mRNA，这是疫苗的关键成分物质，然后进行纯化。第三个也是最后一个主要步骤是将高度纯化的mRNA包封进LNP中 (图6)。工艺步骤的顺序是在评估mRNA生产的当前状态后选择的。质粒的生产基于Urthaler等人发表的信息。由于线性化不需要通常的异构体分离，该工艺基于单个AEX层析单元。mRNA生产的工艺规模与辉瑞提供的信息相当，其能够在单个40L批次中生产多达1000万剂药物产品。在200 L的发酵批次 (2g /L)中进行相应规模的pDNA生产。较低的产物滴度，例如1 g/L，将导致需要400L的发酵批次，以及在收获阶段4倍的浓缩，而不是2倍。
图6. 质粒生产、质量检测和mRNA生产工艺概述。该工艺包括三个主要步骤，质粒生产、线性化和体外转录。在线性化和mRNA纯化之后，需要进行大量的质量检测。
工艺模拟
发酵
不同kL值下发酵运行的模拟结果如图7所示。实线为kLa值为0.87 s-1的发酵结果，虚线为kLa值偏差±10%的发酵结果。点表示从文献中获取的实验结果。
图7. 比较发酵过程中(a)生物量和(b)pDNA浓度的文献和模拟数据。以不同的kLa值进行了多次模拟运行。虚线表示最大和最小生物量以及质粒浓度。
重悬和碱裂解
碱裂解后的浓度趋势如图8所示。进入裂解后，细胞立即被破坏，pDNA和细胞内杂质被释放。根据Urthaler等人的数据，这个过程在10秒后可完成67%，可以用过程模型来描述。当杂质浓度保持恒定时，一旦所有细胞被裂解，sc-pDNA的浓度会由于不需要的异构体的形成而降低。
图8. 碱裂解过程中sc-pDNA和蛋白质杂质的浓度趋势。大肠杆菌细胞的裂解在进入裂解通路后不久即完成。停留时间过长会导致所需要的构型退化为不需要的异构体。
超滤浓缩
碱裂解后，用超滤法浓缩pDNA。已经发表了一些关于pDNA超滤的研究。除了研究基本的筛分和折叠机制，例如通过电解液的加入，只有少数案例研究提供了具有过程代表性的参数数据。本文利用Urthaler等人以及Repligen发表的数据进行了可靠的比较。在这一步骤中，在41LMH通量和0.4 bar跨膜压条件下，浓度增加了5倍 (图9)。
图9. 浓缩步骤的浓度、工艺体积和通量趋势。过滤以恒定通量进行。这将使浓度呈指数级增长。90分钟后，浓度增加了5倍。
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AEX纯化pDNA
小规模整体柱的模拟结果与文献数据的对比如图10所示。通过盐梯度信号确定弥散传质系数为10-7m2/s；但与对流传质相比，该系数的影响较小。在梯度中观察到的弥散主要受整体柱的结构几何影响。
图10. 文献数据（符号）和模拟数据（线条）的比较。
在图11中描述了AEX捕获的规模放大，为了优化工艺，可以使用高盐上样。该优化工艺如图11所示。采用高盐漂洗，在第一梯度步骤中洗脱的侧组分可被流穿分离，使该工艺步骤的产率由15.294g/(L·d)提高到17.805 g/(L·d)，而收率保持在99%。
图11. 规模放大工艺（a）和优化工艺（b）的比较。
以UF/DF进行浓缩和洗滤
AEX纯化之后以及线性化之前，可使用UF/DF实现浓缩和缓冲液置换。使用与前文相同的模型计算AEX后440 L工艺体积降至浓缩以及9体积洗滤后的100 L（图12和图13)。
图12. 初始的9倍浓缩后，添加洗滤缓冲液，并进行最终的浓缩。过滤在恒定通量条件下进行。这可使浓度呈指数级增长。60分钟后浓度增加9倍。
图13. 9 DV洗滤后，浓缩至终体积100 L，效价3.1g/L。过滤在恒定通量条件下进行。这可使浓度呈指数级增长。90分钟后，浓度增加了5倍。
线性化
在mRNA生产中，pDNA模板通常使用限制性内切酶线性化，以防止转录通读。模拟时，采用文献报道的EcoRI限制性内切酶的动力学参数。pDNA和EcoRI浓度取自文献数据。3.1 g/L pDNA的线性化时间约为2.6h，与文献数据一致。由于针对pDNA的EcoRI的KM值较低，反应几乎一直以最大反应速度进行(图14)。
图14. 线性化反应随时间的进展。大约2.6小时后，质粒DNA的线性化完成。反应时间取决于所用的酶和浓度，以及所需的产物浓度和底物周转。
以HIC进行线性化ds-DNA的纯化
图15给出了HIC整体柱的模拟结果。与阴离子交换整体柱相比，产率大大提高，达到61.402g/(L·d)。这主要是由于对工艺的输入浓度较高，导致上样时间明显缩短。然而，需要注意的是，必须在工艺时间中加入整体柱的再生，从而增加了工艺时间，使产率降为34.112g/(L·d)。
图15. 实验室工艺(a)与规模放大工艺(b)的比较。在实验室工艺中，文献数据用符号表示，模拟数据用线条表示。
转录
RNA是由RNA聚合酶在聚合反应中酶法合成的。目前市面上有不同的RNA聚合酶产品，如T7-，T3和Sp6-RNA聚合酶。模拟使用T7-RNA聚合酶的动力学参数(图16)。假设转录序列的长度为669bp，相当于编码SARS-CoV2刺突蛋白RBD从Arg319到Phe 541的序列长度。转录终止于序列的末端，这是先前酶裂解的位置。转录反应完成后，需要对未成熟mRNA进行加帽，并添加poly-A尾。这两个工艺既可以作为单独的酶步骤执行，也可以通过将大约50个核苷酸的poly(T)序列合并到DNA序列中，并将帽类似物添加到反应混合物中，与转录反应一起执行。5’-帽(如m7GpppN)可被mRNA(鸟嘌呤- N7-)甲基转移酶酶化。
图16. mRNA浓度随工艺时间的变化。转录约5小时后完成。线性化取决于所用的酶和浓度，以及所需的产物浓度和底物周转。
以MMC纯化mRNA
混合模式整体柱的模拟结果如图17所示。在(a)中给出了该工艺的文献数据和模拟结果。350 s和650 s处的峰值是由于本文中引入的高盐漂洗造成的，因此没有进行模拟。产物在pH梯度下洗脱。在规模放大工艺中，层析的分辨率变差，导致收率为90%，这在文献和本文后面都有引用。模拟的8L整体柱的产率为18.3g/(L·d)。
图17. 实验室工艺(a)与规模放大工艺(b)的比较。在实验室工艺中，文献数据用符号表示，模拟数据用线条表示。
以RPC纯化mRNA
RP整体柱的模拟结果与实验室数据的对比如图18所示。模拟的实验室工艺的数据用符号表示，模拟结果用直线表示。
图18. 以符号给出RP整体柱的实验室数据；以线条给出模拟数据。
规模放大时，可以通过模拟探索类似于HIC的优化方法。在实验室工艺中使用6.5%乙腈的漂洗步骤，可以集成到层析柱上样中。低乙腈和高乙腈上样的比较如图19所示。如果采用高乙腈上样，工艺时间可显著缩短。这也可能增加结合载量，因为它会在一定程度上阻碍竞争性吸附，如HIC工艺所述。基于更短的工艺时间，产率由43.5 g/(L· d)提高到87.1g/(L· d)。
图19. 实验室工艺（a）和优化的实验室工艺（b）的规模放大的比较。
mRNA的冻干
为了模拟冻干工艺，需要两个模型参数：小瓶传热和水力流量阻力。这些参数取自文献报道。对于本研究，假设中试和生产规模传热系数相似。由于更高的过度冷却，生产规模增加了水力流量阻力。由于辐射，处于边缘的小瓶在冻干过程中接收到更高的热输入。因此，可以得到两个关键的小瓶。第一个瓶子获得最高的热量输入，因此限制了货架温度，而最冷的小瓶决定了最短的工艺时间。保持产品温度低于“崩溃”温度是非常重要的，以保持足够长的初级干燥阶段。不同小瓶的冻干过程如图20所示。
图20. 货架和产品温度趋势。
货架温度在6h内由-40℃升高至-10℃，随后保持11 h。在初级干燥过程中，腔室压力降低至0.16mbar。二级干燥开始时，温度在3h内从-10 ℃升至20℃，腔室压力降低到0.068mbar。这个温度保持7小时。两个产品温度都从-40℃开始，逐渐接近货架温度。与较冷的小瓶相比，最热小瓶的产品温度上升到货架温度的速度更快，因为它通过辐射受到更高的热输入。因此，小瓶的干燥过程完成得更快。最冷小瓶的干燥过程较慢。最冷小瓶的产品温度在初级干燥结束前达到货架温度。因此，可以认为初级干燥过程已经完成，二级干燥开始。由于结合水已经可以在初级干燥阶段被解吸，最热小瓶的产品温度接近货架温度。相反，最冷小瓶在干燥的基质中有更多的解吸水，因此用于解吸的能量很大。小瓶的最终残留水分约为1.5%。
对于先进工艺控制，PAT的可行性
mRNA生产中的数字孪生依赖于在线过程数据，其将信息实时提供给工程模型。除了简单的工艺参数，如压力、电导率、pH值、温度等，目标成分和主要杂质的浓度也是必要的，以确保从数字孪生中收集的信息是可靠的。拉曼、FTIR、UV-vis、荧光和圆二色谱等光谱技术已经被证明是各种生物药生产过程中合适的检测方法。
为了评估APC赋能技术的潜力，我们通过拉曼光谱(拉曼频移1800-400cm-1)、FTIR光谱(吸收频率1800-800 cm-1)以及DAD(波长200-500nm)研究了不同浓度和纯度范围内碱裂解后的质粒浓度。
图21-23显示了原始和加工后的拉曼、FTIR和DAD光谱。关于如何应用正确的前处理和PLS模型构建以及多检测器组合的好处的详细信息之前已有文献分析。拉曼预测pDNA滴度的R2为0.99(R2val为0.85，RMSE为0.04g/L，2因素)。FTIR预测pDNA滴度的R2为0.97 (R2val为0.89，RMSE为0.076 g/L，2因素)。DAD预测pDNA滴度的R2为0.99 (R2val 0.90，RMSE 0.02 g/L，3因素)
图21. 碱裂解和澄清后的拉曼原始光谱(a)和处理光谱(b)以及滴度预测vs. 对照光谱(c)。
图22. 碱裂解和澄清后的FTIR原始光谱(a)和处理后光谱(b)以及滴度预测vs. 对照光谱(c)。
图23. 碱裂解和澄清后的DAD原始光谱(a)和处理后光谱(b)以及滴度预测vs. 对照光谱(c)。
这一初步的可行性研究用很少的数据点清楚地表明，不同的滴度浓度可以通过最先进的光谱技术来区分。因此，对不同批次和工艺步骤的工艺规模进行详细的研究是值得的。实验室规模的方法已经存在，比如C Technologies（Repligen子公司）的可变光程UV-Vis光谱。
相关视频：C Technologies SoloVPE技术工作原理
结合本文提出的数字孪生，任何PAT策略都将允许先进的过程控制实施到自主操作，以减少OOS（不符合规格）批次失败、合格人员瓶颈以及稀有化学品的使用。这也将提高产率 – 亦即，向市场提供更多的疫苗。此外，任何启动培训模拟都将使新设备和工厂减少鉴定和验证时间成为可能。
讨论
总pDNA到mRNA工艺的数字孪生结果总结如下：纯度、产量和滴度浓度是工艺性能评价的关键特征数字，总结在图24和25中。
图24. 质粒生产和线性化过程中滴度、体积(a)以及纯度和产量(b)的概况。
图25. mRNA生产过程中滴度、体积(a)以及纯度和产量(b)的概况。
在裂解过程中，pDNA工艺显示出了明显的较大程度稀释(大约10倍)，是解除工艺瓶颈的第一个方法。其次，目标是降低进一步处理mRNA所需的层析步骤数，特别是高效转录。高纯度pDNA工艺有分离异构体的目的。所以，对于进一步的mRNA处理，是没有必要的。只有蛋白质、gDNA和内毒素需要分离。第三，1 g pDNA可能产生约30 g mRNA。这将瓶颈转移到了mRNA工艺阶段。
共转录加帽成功地减少了往往伴随着产量损失的纯化步骤的数量。混合模式和反相层析的组合可满足纯度要求。作为在生产规模条件下，已经有标准化设备和材料的成熟单元操作，这些层析步骤比沉淀和乙醇-氯仿萃取等方式具有更高的工业化水平。此外，后者将导致需要ATEX防爆安装和批准。即使是一个层析步骤，AEX或混合模式，结合之后的UF/DF，也可能获得足够的纯度。但是，出于产品安全性的原因，监管机构在审批时，倾向于正交纯化机制的使用。UF/DF可以在LNP制剂前调整最终浓度和缓冲液组成。在这最后一步，选择冻干，因为对于任何患者给药所需的浓度，都可以很容易地通过重悬进行调整。
原文：A.Schmidt, H.Helgers, F.L.Vetter, et al., Digital Twin of mRNA-Based SARS-COVID-19 Vaccine Manufacturing towards Autonomous Operation for Improvementsin Speed, Scale, Robustness, Flexibility and Real-Time Release Testing. Processes, 2021, 9, 748.
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