scale-X™ 生物反应器以MRC-5细胞的生产工艺

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scale-X™ 生物反应器以MRC-5细胞的生产工艺

从静止培养瓶到具有30 m²细胞生长表面积的scale-X生物反应器的工艺

应用笔记

Alex Chatel¹, Yves Ghislain², Pranav Puri³, Tanja Zijdemans³

¹ Univercells Technologies; ² Quantoom Biosciences; ³ Batavia Biosciences

摘要

由于风疹疾病的疫苗供应缺口，全体免疫在世界上的一些地区仍然受到限制。在本文中，我们将介绍scale-X™ carbo固定床生物反应器系统(30 m²)如何成功地帮助填补风疹疫苗接种的抗原缺口。将MRC-5细胞从静止细胞培养瓶转移到scale-X技术产品线，以进行风疹病毒的生产。首先在scale-X hydro生物反应器中接种并培养细胞，然后进行了多个工艺优化步骤(培养基消耗、接种液密度以及灌流原则)。在证明了细胞在hydro中生长的可行性后，该工艺被成功地规模放大到了scale-X carbo 10和scale-X carbo 30。规模放大后，仍可达到在hydro规模条件下获得的收获原液池10⁶ TCID50 mL^-1的目标病毒滴度。在scale-X carbo 30中获得的生产意味着每批次可以生产达100万剂。

简介

尽管风疹在通常情况下是一种较为温和的疾病，但仍被认为是一个公共卫生问题。它可导致先天性风疹综合征，发生流产、胎儿死亡和婴儿先天性畸形。目前尚无风疹的已知治疗方法，但已有一种安全且有效的疫苗(一剂可降低97%的发病率)^[1]。基于活性衰减病毒的风疹疫苗通常与麻疹和腮腺炎 (MMR) 合并成一个三种疫苗制剂，并广泛用于免疫接种。尽管有了疫苗，风疹发病率仍然很高，即使在有针对其它病原体的免疫政策的国家，这表明在疫苗的可获得性和接种方面规划效率低下。其中一种低效源于可负担的疫苗仍供应不足，特别是在新兴市场，这导致了该疾病的死灰复燃或持续存在。MMR疫苗的全球产能估计约为2.2亿剂，而全球需求为每年4- 4.5亿剂，风疹是实现这一目标的限制性抗原。因此，全球疫苗免疫联盟 (GAVI) 估计，每年必须增加2亿剂风疹疫苗的生产量，以弥补联合制剂中与其它抗原的差距，并满足日常和紧急情况的需要^[3]。

MRC-5贴壁细胞系是一种源于肺成纤维细胞的人细胞系，通常用于风疹疫苗的工业化生产，并已被用于生产其它几种病毒疫苗，包括甲型肝炎 (默克的Vaqta®、葛兰素史克的Havrix®)和狂犬病 (赛诺菲-巴斯德的Imovax®)^[4]。传统上用于以贴壁细胞工业化生产疫苗的技术包括滚瓶、多层细胞培养皿以及在搅拌罐生物反应器中使用的微载体。固定床生物反应器是一种很有价值且相对较新的替代方法，它可实现滚瓶和多层培养皿中多个手动培养步骤的自动化，与在搅拌罐中使用微载体相比，它极大地简化了生物工艺，提供可规模放大的商业化生产。来自Univercells Technologies的scale-X生物反应器系列产品是一种可规模放大的结构化卷式固定床生物反应器解决方案，可用于从研究 (scale-X hydro, 2.4 m²生长表面) 到临床(scale-X carbo 10和30m²) 和商业化 (scale-X nitro, 200和600m²) 的应用。在scale-X生物反应器中，固定床的专利创新结构可实现生物反应器内均匀的细胞分布和液体流动规律，与其它随机填充的商业化生物反应器相比，其可提高批次间的可重复性。

材料、方法和设备

材料

病毒种子：在CellSTACK®10(康宁，USA)中生产了几种工作病毒种子，并以冻存管和小瓶分装，以用于实验工作。工作病毒种子滴度均超过10^5.8 TCID50 mL^-1。

细胞计数：在scale-X生物反应器中，细胞密度的评估通过从固定床中无菌提取预切的取样条进行。将收集到的取样条在细胞裂解缓冲液(试剂A100和B，ChemoMetec，USA)中按预定的时间孵育，然后用结晶紫染色。释放的细胞核使用血球计和光学显微镜手动计数。

接种液生产：用于生物反应器实验的接种液在T75细胞培养瓶（赛默飞世尔，USA）和CellSTACK® 10（康宁，美国）中生产。细胞生长至适合接种生物反应器的最终细胞数量。报告中将进一步说明接种密度。

用于细胞培养和病毒生产的scale-X 生物反应器系列

scale-X hydro 生物反应器

作为最小规模的固定床生物反应器，本研究使用的scale-X hydro可提供2.4 m² 细胞生长表面积。接种细胞前，一次性使用生物反应器高压蒸汽灭菌。pH和溶氧(DO)分别使用氧化还原和光学探针(Hamilton EasyFerm和VisiFerm，Hamilton，CH)测量，温度(T°)使用标准PT100温度探针(Jumo Automation，DE)测量。控制器通过使用添加碱的蠕动泵、添加空气、氧气和二氧化碳的气体质量流速控制器以及加热元件，确保维持pH、DO和T°。生物反应器连接到一个管汇套件，其为流体管理提供完整一次性使用解决方案，包括在细胞培养期间添加接种液、碱以及补充培养基。

图 1：scale-X hydro 生物反应器系统

scale-X carbo 生物反应器

scale-X carbo系统包括两种生物反应器尺寸 (10和30m²生长面积)，通过与细胞培养相同的界面控制串联TFF浓缩。细胞接种前，一次性使用生物反应器高压蒸汽灭菌。控制 (pH、DO和T)与scale-X hydro(见上文)相同。scale-X carbo通过使用符合21CFR part 11要求的控制系统，并为生物反应器提供GMP材料认证包，而兼容GMP环境。

图 2：scale-X carbo 生物反应器系统

使用贴壁细胞培养的病毒生产

风疹病毒生产工艺可总结为以下几个步骤：

1. 在生物反应器中进行细胞接种和扩增；

2. 生长培养基漂洗；

3. 病毒吸附；

4. 病毒扩增；

5. 病毒生产和收获

本文描述的工艺优化路径如图3所示。首先是将之前建立的培养瓶工艺 (T75瓶，作为比较生物反应器培养的对照) 转移到scale-X hydro生物反应器，进行可行性评估，不做优化。之后，工艺优化的重点是简化种子扩增链、确定最佳培养基消耗、开发灌流工艺，并在不影响病毒产率的情况下，从最后的病毒生产阶段去除血清。最后，先规模放大至scale-X carbo 10，再放大至scale-X carbo 30，同时以保持产率为目标。

图 3：从静止细胞培养瓶到scale-X hydro 和scale-X carbo的工艺优化路径

4. 工艺优化路径

从静止培养瓶到scale-X hydro

工艺优化的第一步是将静止细胞培养瓶工艺直接转移到scale-X hydro生物反应器。接种细胞密度为10,000 cells cm^-2，使用添加10% FBS的DMEM培养基，培养基与固定床表面的比例为0.17 mL cm^-2。细胞培养在循环模式下进行的，即培养基从外部容器循环通过生物反应器，确保达到单位表面积的目标体积 (见图4)。

图 4：scale-X hydro 细胞培养，不进行工艺优化。培养基使用：0.17 mL / cm² DMEM + 10% FBS，接种密度 10,000 cells cm^-2。

● 静止细胞培养瓶对照  ● scale-X hydro

（n=2，误差条=范围）第五天出现较大的误差条，可能是由于细胞计数错误。

优化 scale-Xhydro 生物反应器中的接种密度并确定最佳培养基消耗

实验决定研究是否可以通过降低接种密度以简化种子扩增步骤，操作通过比较对照工艺 (即10,000 cells cm^-2)和6,500和5,000 cells cm^-2的较低密度进行。

图5：在scale-X hydro 生物反应器中，降低细胞密度对最终细胞浓度(■) 和细胞群体倍增时间(■)的影响。除接种密度外，两个实验使用相同的条件（更多细节，参见图 4 ）。

达到目标病毒产物浓度(使用血清)

风疹病毒的感染和病毒生产分两个不同的阶段进行：最初的病毒扩增以及随后的实际病毒生产步骤，在此期间收获病毒。在本研究中，风疹病毒的目标滴度设定为10⁶ TCID50 mL^-1。

图5表明，scale-X hydro中的接种液密度可以成功地从10,000降低至5,000 cells cm^-2 ，且只要延长两天 (即从4天至6天)，不会影响细胞培养的性能 (以细胞密度 (分别为115.6 K和105.2K cells cm^-2) 和生长率 (分别为0.86 vs. 0.73 PDL/day) 判定)。图6显示了如何通过达到至少0.4mL cm^-2的培养基体积与表面积比来优化细胞生长。

图6：scale-X hydro 生物反应器中，培养基体积与表面积之比对细胞生长影响的研究

● 0.17 mL cm^-2，● 0.28 mL cm^-2，● 0.39 mL cm^-2和● 0.50 mL cm^-2。

该值被考虑作为评估工艺成功的基准 (需要等于或高于该值)。 

病毒感染使用含血清的生产培养基 (4% FBS)，以固定MOI (MOI = 0.13)进行。图7显示3天后达到的病毒滴度超过了对照目标 (10⁶ TCID50 mL^-1)。用于细胞生长的培养基体积与表面比为0.17 mL cm^-2 (注意，这与细胞生长培养基不同)，并且每两天更新一次 (即当其被完全消耗时)。

图7：scale-X hydro生物反应器中的病毒滴度，生产培养基体积与表面积比为0.17mL cm^-2 (每两天更换)。scale-X hydro 静止细胞培养瓶中的对照生产滴度 (仅第10天) 。(a)显示随感染后时间变化的生物反应器滴度，而(b)显示收获池滴度(第10天总体积 = 18.4 L)。

实施灌流工艺

灌流工艺的使用是希望实现的目标，因其可以实现在线处理，即细胞培养可以与澄清和纯化步骤链接。因此，这只适用于病毒生产阶段，期间，含有产物的工艺液流可以在线纯化。使用与前文所述相同的 (含血清) 培养基与生产可用表面积比例 (即0.17 mL cm^-2)，但分散到2天中，即培养基供应速率为0.085 mL cm^-2 day^-1。图8显示病毒滴度在感染后3天超过了10⁶ TCID 50 mL^-1的目标(数据仅显示到第10天)。

图8：scale-X hydro生物反应器灌流模式下的病毒滴度，使用含血清培养基。● scale-X hydro ● 静止细胞培养瓶中的对照产率 (第4天和第10天)。(a)显示随感染后时间变化的生物反应器滴度，而(b)显示收获池滴度(第10天总体积 = 18.4 L)。 

从病毒生产阶段去除血清

去除动物血清是产生风疹病毒的法规要求^[5]。初步研究表明，在病毒产生阶段去除血清意味着无法达到10⁶ TCID50 mL^-1的目标滴度。

推测有两个因素导致了所观察到的滴度下降。首先，病毒扩增期间 (即产生病毒的两个阶段中的第一个阶段) 细胞中残留的血清过低，扩增阶段持续时间过短。第二，血清稳定了病毒，如果去除血清，应该使用稳定剂来代替它。

实验通过分别使用人血清白蛋白(HSA)或固定组合的蔗糖/磷酸盐/谷氨酸 (SPG) 混合液(未公开) 对此进行了测试。

两种推测都在T瓶中进行了测试，结果表明，通过将病毒扩增期延长至3天并添加HSA，在病毒生产阶段的无需血清操作可达到目标产物浓度。在scale-X hydro生物反应器中进行了相同的实验，得到了相似的结果。

图9：scale-X hydro生物反应器灌流模式下的病毒滴度，不使用血清 (无FBS)。● scale-X hydro。注意，没有达到10⁶ TCID50的目标滴度。(a)显示随感染后时间变化的生物反应器滴度，而(b)显示收获池滴度 (第10天总体积 = 18.4 L)。注意，本实验没有对照。

从 scale-X hydro 规模放大至 scale-X carbo 10 和 30

该工艺首先从scale-X hydro放大到了scale-X carbo 10，然后放大到了scale-X carbo 30。直接应用scale-X hydro中定义的细胞密度和培养基消耗参数。接种液的质量对于确保在scale-X hydro和scale-X carbo内的均匀细胞分布和等量细胞生长至关重要。研究考虑了多个因素，以确保均质性和细胞生长相当性：

◀ 细胞单个化：确保细胞在从接种培养瓶中酶解脱落时有适当的单个化。

◀ 时间：降低接种液收集和细胞接种之间的时间；

◀ 操作：以批次模式进行接种；

◀ 操作体积：确保生物反应器中加入了最佳的接种液体积。

通过确保这些因素的应用，在scale-X carbo 10和30中获得的生长曲线和最终细胞密度与scale-X hydro中看到的相同 (数据未显示)。此外，通过应用与在scale-X hydro中开发的相同工艺，即从病毒生产阶段去除血清，scale-X carbo 10和30的产物滴度分别达到10^6.15和10^5.95 TCID50 mL^-1 (见图10)。尽管scale-X carbo 30低于目标滴度 (即10⁶ TCID50 mL^-1)，但放大可认为是成功的。

图10：以灌流模式操作的scale-X carbo生物反应器的病毒滴度，其在病毒生产阶段不使用血清 (以人血清白蛋白 (HSA) 代替)。● scale-X carbo 10 ● scale-X carbo 30 ● 静止细胞培养瓶中的对照滴度 (第七天)。以10^6.0 TCID50/mL为目标，收获池滴度10^5.95可认为是成功的。(A)显示随感染后时间变化的生物反应器滴度，而(b)显示收获池滴度(第10天总体积= 76.5 L)。

总结

通过原本在静止细胞培养瓶 (由Batavia Biosciences开发)中进行的工艺转移至scale-X固定床生物反应器，并进行优化和规模放大，结果表明，预先设定的目标病毒滴度 (>10⁶ TCID50 mL^-1) 可以达到 (10^5.95 - 见图10 - 被认为在此工艺的成功标准可接受范围内)，且同时确保接种获得可预测的细胞生长趋势，优化培养基消耗，开发灌流生产工艺，并从病毒生产阶段去除血清。

建立的无血清灌流工艺第一次规模放大到了scale-X carbo 10，然后又放大到了scale-X carbo 30，并成功达到了滴度目标。

Batavia Biosciences将对获得的风疹病毒疫苗工艺 (参见图11)进行进一步的开发和优化。基于可用的数据估算，使用一台scale-X carbo 30生物反应器，每批次最多可生产1百万剂。这是根据实验数据计算得出的。

根据预期目标，该工艺还可以进一步扩大到scale-X nitro，其具有高达600 m² 的细胞培养面积，这意味着每批2060万剂量。

* Univercells Technologies, Quantoom Biosciences& Batavia Biosciences 估算

图11：优化的风疹疫苗生产工艺，在病毒生产阶段不使用血清，在生产过程中使用灌流。

参考文献

[1] WorldHealth Organization, "1," 4 October 2019. [Online]. Available: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/rubella.[Accessed 26 July 2021].

[2] StrategyAdvisory Group of Experts on Immunization , "2018 Assessment Report of theGlobal Vaccines Action Plan," World Health Organization, Geneva, 2018.

[3] "Global market study Measles-containing vaccines (MCV)," World HealthOrganization, 2020.

[4] M.Wadman, "Fact-checking Congress’s fetal tissue report," AmericanAssociation for the Advancement of Science,5 January 2017.

[5]"Quality of biotechnological products: viral safety evaluation of biotechnologyproducts derived from cell lines of human or animal origin," EuropeanMedicines Agency, London, 1997.

[6] FDA,"Highlights of prescribing information - Mumps-Measles- Rubella virus vaccines,"Accessed on 14/07/2021. [Online]. Available:https://www.fda.gov/media/75191/download.

致谢

Univercells与合作伙伴Batavia Biosciences获得了比尔和梅林达·盖茨基金会的一笔赠款，用于开发生产GMP M&R原料药的低成本疫苗生产平台。本研究中介绍的项目是联盟成员Batavia Biosciences以及Univercells (由Quantoom Biosciences和Univercells Technologies代表) 合作完成的。

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