提高整合或强化工艺中Protein A生产率和填料利用率
本文节选自来自Biogen的研究人员发表的文章“Enhancing protein A productivity and resin utilization within integrated or intensified processes”，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
摘要
最近对生物药连续生产的兴趣推动了多柱层析系统的开发和评估，通过提高生产率和最大限度地利用填料来降低填料成本，特别是对于昂贵的Protein A捕获步骤。单通过切向流过滤（SPTFF）可用于降低灌流收获液的体积，使收获步骤的生产率进一步提高多达5倍。然而，捕获步骤的生产率可能存在实际限制，这必须根据生产批次的大小、持续时间和频率来确定，特别是当它涉及到层析柱寿命的有效利用时。对于时间较短的补料分批生产运行来说，强化捕获工艺可以降低高达82%的填料消耗，同时避免使用后填料的长期存储。对于灌流工艺和时间较长的补料分批运行，以较低的生产率进行操作可能更高效，使层析柱寿命可以常规性达到，同时在不引入不必要的工艺风险或复杂性的情况下，实现所需的填料和缓冲液节省。本研究中，一种强化的批次捕获工艺，“超批次”，将作为多柱层析工艺的替代方法进行比较，以通过一个潜在的、更简单的工艺，实现高生产率和填料利用率。
简介
在过去的十年中，用于生物药生产的连续工艺因其连续操作的预期效益而获得了广泛的关注，包括产物质量一致、更低的设备尺寸、精简的工艺流，以及更低资本投入和运营成本，这些最终可转化向患者提供重组生物治疗药物方面的好处。在下游工艺中，捕获步骤受到的关注最多，因为对于典型的单克隆抗体工艺来说，它利用了最昂贵的下游原材料。与批次层析相比，多柱层析系统在提高生产率、填料利用率以及降低缓冲液消耗方面的能力已经得到了广泛的评估，特别是在捕获步骤方面。Baur等人通过展示不同的产物浓度和工艺限制 (如CIP接触时间)如何在比较批次和多柱层析工艺的生产率和填料利用率时导致不同的结论，进一步扩展了这一分析。然而，在这些比较中通常考虑的批次工艺是一个相对不优化的工艺，这可能会导致多柱层析更有利的结果。
已经有很多这样的例子，即对单柱操作进行优化，以满足更强化的工艺的要求。层析柱可过载至70%，而层析柱流出液中的任何产物流穿可循环回至上样罐，从而在不造成产物损失的情况下，成功使填料的利用率最大化，但这也提高了工艺的复杂性和工艺时间，因为每个循环的上样浓度降低了。在Fc-融合蛋白纯化工艺中，可使用了两种上样流速，以提高捕获步骤的产率，同时仍然使填料的利用率最大化。Guo等人提出了一种“超批次”（Super Batch）工艺，该工艺利用较低的柱床高度来实现更快的流速和更高的捕获步骤产率，同时接受较低的填料利用率。他们对超批次工艺进行了进一步的优化，采用多达四种不同的上样流速，在三种不同的进料浓度下，其生产率与多柱层析系统相似，同时，在超批次配置中，填料利用率降低了16%。类似地，也有团队开发了单柱连续层析 (OCC) 方法，作为使用MabSelect Protein A介质高效纯化灌流液的一种选择，其可同时保持进样缓冲罐中的最小体积。我们将在这些建议方案的基础上，采用只有两个上样流速的超批次方法，来提高灌流和补料分批生产工艺的捕获效率，同时达到与多柱层析系统相似的填料利用率。我们还通过仅利用两个上样流速来提高生产率，同时实现与多柱层析系统相当的填料利用率，从而证明并补充了这种超批次概念。
根据在这些案例研究中观察到的进样浓缩因子，考虑附加工艺浓缩技术，以评估它们在强化或类似连续的下游操作中的潜在作用是合乎逻辑的。我们可以看到，通过降低在上样阶段花费的时间，生产率可以在更高的浓度下大幅提高。单通过切向流过滤 (SPTFF) 之前已经在补料分批工艺中进行了评估，以消除收获步骤或捕获洗脱步骤的瓶颈，同时获得高浓度制剂。但它也可以用于提高灌流收获中的产物浓度，以实现这些更高的捕获产率。我们将展示一种高通量SPTFF工艺，其采用一次性使用的超滤设备，从灌流生物反应器中持续浓缩收获液，使我们能够进一步优化捕获效率。
我们已经讨论了提高捕获步骤产率的各种方法，但是我们还必须考虑产率指标如何转化为生产中的效益。产率通常是根据可获得的填料上样以及完成一个循环所需的时间来计算的，并以每升填料每小时纯化的蛋白质克数(g/L/h)来表示。因此，更高的捕获产率表明，我们可以使用更小的层析柱，通过实现更快的柱循环，在特定的时间限制内，处理相同数量的产物。然而，我们还必须考虑层析柱的结合载量和层析柱的使用寿命，以评估在更长的生产批次或生产活动中，更高的产率是否可使纯化相同数量的产物所需的填料体积在总体上的降低。我们假设，在可以常规实现层析柱生命周期的场景中，对于要求操作要求以略低的产率运行的捕获步骤产率起来说，可能存在实际限制，因为竞争性的生产工艺操作会影响生产成本。如果由于活动时间短，填料的利用效率不高，则有可能通过实施更高产率的捕获工艺来大幅降低填料成本。在本文中，我们将利用灌流和补料分批生产生物反应器的案例研究，以确定哪里可能有机会进行优化，但除了其它潜在的优势外，不一定可以最大限度地提高捕获效率，以实现填料节约。
材料和方法
灌流工艺：灌流生物反应器配置XCell ATF细胞截留装置（Repligen），使用专利灌流培养基进行了5种不同单克隆抗体（mAb）的实验室规模（3L）灌流生产，灌流速率恒定为2VVD。其中，mAb1的灌流工艺规模放大至50L中试规模。
SPTFF开发：在实验室规模中，ATF灌流液以1-26 ml/min的流速泵动通过单个88cm2 Pellicon 3 Ultracel 再生纤维素过滤器（C型筛网），通过管阀控制压力为10psi。通过计算累积的回流和滤液体积，计算单位体积浓缩因子（VVF）。
使用Pellicon 3 30kD Ultracel再生纤维素过滤器（C型筛网）的单阶段、单通过切向流过滤的实验设置。实验室规模和中试规模中，分别使用管阀或蠕动泵控制回流流速。
中试规模验证：50L灌流生产生物反应器的ATF灌流液从第8天开始使用Pellicon滤器连续浓缩，至第30天结束（或当进样压力达到15psi时，以过滤器污染为由结束）。SPTFF的进样流速控制为69ml/min，以匹配灌流液流速。管路为预灭菌形式，采用无菌快接头。该步骤连接至使用4柱方法的BioSMB PD层析系统（Sartorius）或使用CaptureSMB 工艺的Contichrom Twin100 LPLC（YMC Process Technologies）。系统和层析柱使用Perasan A（Envirotech）消毒，以建立封闭系统。
Protein A 捕获工艺：层析柱装填Praesto® Jetted A50 protein A亲和填料（Purolite），柱床高度5-10cm，并测试了不同的柱径规格。层析柱先平衡，然后以75g/L为目标上样，然后层析柱漂洗和洗脱，再以0.1 M氢氧化钠、20%乙二醇再生，最低接触时间30min。为确定超批次工艺的操作条件，评估了MabSelect SuRe LX和Jetted A50的动态结合载量，以2-12min的固定保留时间上样。目标上样比确定为层析柱的85%，此时A280检测到10%流穿。超批次工艺在中试规模灌流生物反应器上进行了确认，使用ÄKTA pure 层析系统及装填5mL Jetted A50的MiniChrom预装柱（5 x 100mm，Repligen）。层析柱上样ATF灌流液，其中含mAb1浓度为1.3或9.3 g/L，在2min保留时间下约为55g/L填料，保留时间增加至9min时，达到目标上样75g/L。
结果
详细实验结果，请参考原文。
对于15或30天灌流工艺，在不断提高的生产率条件下操作时的捕获层析柱尺寸
针对不同运行条件的强化补料分批工艺的捕获层析柱尺寸
总结
我们证实了一种稳健的单阶段SPTFF工艺的开发，其利用一次性使用Pellicon滤器装置浓缩灌流生物反应器收获液。通过安装额外的过滤面积并降低标准进样流速，SPTFF过滤器的处理能力可以大大提升，这样一套过滤器可以用于超过22天的工艺。该工艺已成功地用于中试规模的50 L灌流生物反应器，同时连接到多柱层析系统。通过使用预灭菌的一次性使用管路和Perasan A对层析柱和可重复使用部件进行消毒，可维持从灌流生物反应器到SPTFF和最后捕获步骤的无生物负荷环境。在连续生产工艺中引入SPTFF步骤可以使捕获步骤的生产率提高高达150%。类似的生产率可以通过超批次或多柱层析工艺实现，当连续或混合生产工艺被更广泛地采用时，可确保规模放大的灵活性。
然而，当评估由更高生产率的步骤所提供的价值时，我们还必须考虑生产工艺的预期物料产量以及每年的计划批次。我们认为，对于每个生产场景，捕获步骤的生产率存在实际限制。对于灌流工艺，这可以根据层析柱的寿命和批次的持续时间来确定，以避免在批次中间更换层析柱，因为这可能需要重新建立封闭系统。对于补料分批工艺，我们还必须考虑每个生产活动的批次数。生产率是比较工艺配置的一个有用的指标，但生产率最低的工艺可以在不更换层析柱或拆装/重新装柱的情况下达到层析柱的寿命，从而在不引入不必要的工艺复杂性的情况下，实现填料的节约。
原文：A.Brinkmann, S.Elouafiq, Enhancing protein A productivity and resin utilization within integrated or intensified processes. Biotechnology & Bioengineering, 2021, DOI:10.1002/bit.27733.
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